實驗室常用的離心方法

發布時間：

2014-03-17

概要：

(1)差速離心法(又稱分步離心法) 采用不同的離心速度和離心時間,使沉降速度不同的顆粒分步離心的方法,稱為差速離心。操作時,將含有兩種不同顆粒的混懸液,以常速離心，使大的顆粒下沉，將上清液傾倒于另一離心管中，再加大離心力，離心一定時間，分離小的顆粒，反復多次分離，達到分離目的。差速離心主要用于分離大小和密度差異較大的顆粒。差速離心法的優點是：操作簡單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開，并可使用容量較大的角式轉子；分離時間短、重復性高；樣品處理量大。缺點是：分辨率有限、分離效果差，沉淀系數在同一個數量級內的各種粒子不容易分開，不能一次得到純顆粒；壁效應嚴重，特別是當顆粒很大或濃度很高時，在離心管一側會出現沉淀；顆粒被擠壓，離心力過大、離心時間過長會使顆粒變形、聚集而失活。

圖-1 差速離心法原理示意圖

(2)密度梯度離心法(又稱區帶離心法) 該法又分為速率區帶離心法和等密度區帶離心法。樣品在一定惰性梯度介質中進行離心沉淀或沉降平衡，在一定離心力下把顆粒分配到梯度液中某些特定位置上，形成不同區帶的分離方法。該法的優點是：具有很好的分辨率，分離效果好，可一次獲得較純顆粒；適用范圍廣，既能分離沉淀系數差的顆粒，又能分離有一定浮力密度的顆粒；顆粒不會積壓變形，能保持顆粒活性，并防止已形成的區帶由于對流而引起混合。缺點是：離心時間較長；需要制備梯度液；操作嚴格，不宜掌握。
①速率區帶離心法：是根據分離的粒子在離心力作用下，在梯度液中沉降速度的不同，離心后具有不同沉降速度的粒子處于不同的密度梯度層內形成幾條分開的樣品區帶，達到彼此分離的目的。臨床常使用的分離液是Ficoll、Percoll及蔗糖。把靜脈血中單個核細胞分離出來，前一種分離液將血液中單個核細胞（淋巴細胞和單核細胞）分為一個層，同時提出。而Percoll分離液將血中淋巴細胞和單核細胞分為二個梯度層，分別提取。后者分離效果優于前者，但操作繁瑣。

圖-2 速率區帶離心示意圖

②等密度區帶離心法：當不同顆粒存在浮力密度差時，在離心力場下，顆粒或向下沉降，或向上浮起，一直沿梯度移動到它們密度恰好相等的位置上（即等密度點）形成區帶，稱為等密度區帶離心法。等密度區帶離心的有效分離取決于顆粒的浮力密度差，密度差越大，分離效果越好，與顆粒的大小和形狀無關，但后兩者決定著達到平衡的速率、時間和區帶的寬度。

圖-3 等密度區帶離心示意圖

（3)分析性超速離心法
①分析型超速離心機的工作原理：分析型超速離心機主要由一個橢圓形的轉子、一套真空系統和一套光學系統所組成。該轉子通過一個柔性的軸連接成一個高速的驅動裝置，此軸可使轉子在旋轉時形成自己的軸。轉子在一個冷凍的真空腔中旋轉，其容納兩個小室：分析室和配衡室。分析室的容量一般為1ml，呈扇形排列在轉子中，其工作原理與一個普通水平轉子相同。分析室有上下兩個平面的石英窗，離心機中裝有的光學系統可保證在整個離心期間都能觀察小室中正在沉降的物質，可以通過對紫外光的吸收（如對蛋白質和DNA）或折射率的不同對沉降物進行監測。在分析室中物質沉降時重粒子和輕粒子之間形成的界面就像一個折射的透鏡，結果在檢測系統的照相底板上產出一個“峰”，由于沉降不斷進行，界面向前推進，故“峰”也在移動，從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。

圖-4 分析型超速離心系統示意圖