低速大容量離心機分離免疫細胞技術

發(fā)布時間：

2014-03-21

概要：

每次2000r／min 離心10min，最后用RPMI l640 培養(yǎng)液將細胞配成2×106／m1 的細胞懸液備用

一、免疫細胞分離技術

1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋后，沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(nèi)(注意勿與分離液混合，然后2000r／min 水平離心20min，管內(nèi)分為4 層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位于細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然后用Hanks 液洗兩次，每次2000r／min 離心10min，最后用RPMI l640 培養(yǎng)液將細胞配成2×106／m1 的細胞懸液備用。

2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液通過尼龍棉柱，B 細胞粘附于尼龍棉上，T細胞則不粘附，先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱，流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然后用力反復擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞，并用少量的RPMI l640 培基洗脫，此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少，視分離細胞的多少而定。

3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
（1）CD4 細胞的分離：將一定量的T 細胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱，然后用少量的RPMll640 培養(yǎng)洗滌，收獲的細胞懸液約含85％的CD4 細胞。
（2）CD8 細胞分離：用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg／m1)包被一平皿表面，然后放置4℃過夜，沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然后將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿內(nèi)，4℃放置2 小時，用PBS 輕輕洗凈末粘附的細胞，然后用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經(jīng)洗滌后懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。

4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴細胞則無此特性，借此可將這兩類細胞分開，其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑料或玻璃平皿內(nèi)，置于37℃ C02 溫箱內(nèi)溫育1 小時，然后用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面，去除非粘附細胞，再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷，收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞，可重復上述過程。

二、腫瘤細胞株的傳代培養(yǎng)
傳代細胞是指來自人或動物的腫瘤組織或正常組織的細胞，其染色體組型發(fā)展為非整倍體或二倍體低于75％，這種非整倍體細胞在體外具有無限傳代的生命力，通常具有異種移植的能力和較廣泛的病毒敏感性。傳代細胞的特性是：①具恒定繁殖特性，少數(shù)細胞即有繁殖能力，在瓊脂內(nèi)能形成克隆；有的為貼壁生長，有的懸浮生長。②染色體組型為異倍體，大多數(shù)人源細胞染色體為60－70 條左右。③保留種屬特異性，但組織分化性與臟器特性均消失。④具致癌性。由于傳代細胞繁殖迅速，易獲取、易保存，已為各實驗室廣泛采用。

1、HeLa 細胞的傳代培養(yǎng)
試劑與儀器
●HeLa 細胞。
●Hanks 液，0．25％胰蛋白酶，0．02％EDTA，生長液，青、鏈霉素(PS)，5．6％NaHCO3
●小三角燒瓶，培養(yǎng)瓶，無菌吸液管(5m1 及1m1)、毛滴管，廢液瓶等。
方法與步驟
（1）選生長良好的HeLa 細胞一瓶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶數(shù)次，懸浮起浮著在細胞表面的碎片，然后連同生長液一起倒出，用Hanks 液洗一次。
（2）從無細胞面?zhèn)燃尤?．25％胰蛋白酶液或胰蛋白酶一EDTA 消化液4－5ml，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使消化液浸沒細胞1min 左右。
（3）翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，放置5—10min，為促進細胞的消化，可以加入37℃預熱的消化液，或在細胞面向上時，用手掌貼著細胞面的瓶外壁，待肉眼觀察細胞面出現(xiàn)布紋孔狀為止。
（4）倒出消化液，如系EDTA 消化，需沿細胞層的對面加Hanks 液4．5m1 洗滌，洗滌時輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶，讓液體在瓶內(nèi)慢慢流動，以洗掉消化液；如系胰蛋白酶消化，倒掉胰酶后可不洗滌。
（5）沿細胞面加入適量新配制的生長液，洗下細胞，并用吸管吹打數(shù)次，使細胞分散開，按1：2 或1：3 分配傳代培養(yǎng)。
（6）37℃培養(yǎng)，接種后30min 左右可貼壁，48 小時可換生長液，一般3—4 天可形成單層，形成單層后再換維持液供試驗用。

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